〔劉典謨 段俊國／成都中醫藥大學，四川 成都610037〕
【文章編號】1007—8517 (2012)08～0055—02
目的：研究臺灣特產牛樟芝滴丸的護肝功效。
方法：採用以自動生化分析儀檢測肝功能GOT、GPT生化指數；抗氧化功能相關產物麩胱甘、麩胱甘過氧化酶、超氧化物歧化酶及蛋白質濃度活性分析，以評估肝功能效價。
結果：
血中肝功能生化指數檢測結果顯示，大白鼠腹腔注射APAP會升高血中GOT及GPT指數，肝臟細胞的GSH濃度也會減少，SOD及GPx的酵素活性也都下降。
牛樟芝滴丸可降低GOT及GPT指數，升高GSH濃度；牛樟芝滴丸可回復SOD及GPx等相關抗氧化酶的酵素活性的表現，對於保護肝臟功能確有幫助。
牛樟芝(Antrodia camphorata)為僅生長在臺灣特有的牛樟樹上，為臺灣珍貴特有的真菌，經常被應用于養生保健上。早期臺灣原住民用來治療因飲酒過度所造成的肝臟病變，被原住民視為珍寶。
樟芝子實體和一般的食藥用蕈菇類一樣具有複雜的成分，包括多醣體、三帖類(triterpenoids)、超氧歧化酵素(superoxidedismutase)。這些成分的生理活性功能包括：抗腫瘤、提升免疫能力、抗病毒、抗過敏、抗高血壓、抑制血小板凝集、降血醣、降膽固醇、抗細菌及保護肝臟。
目前對牛樟芝的研究方向以樟芝子實體甲醇萃取物或水萃取物之抗氧化、抗癌、及保護肝臟為主。前期研究採用滴丸製劑改善牛樟芝水不溶性成分吸收研究，本研究將繼續探討其新劑型的護肝功效。
1．方法
1．1 實驗設計
將每組12只以上雄性BALB／c小鼠(20—25克)分為6組，分別為：
A．正常對照組：生理食鹽水(I．P．) +d．d．H O(P．O．)；
B．負對照組(肝損傷組)：400mg APAP／kg bw (I． )+ d．d．I-I20 (P．0．)；
C．正對照組(N—acetylcysteine(NAC)治療對照組)：400mg APAP／kg bw (I．P．) +600mg NAC／kg bw (P．O．)；
D．牛樟芝滴丸一倍劑量(1x)實驗組：400mg APAP／kg bw(I．P．) +牛樟芝滴丸(20顆／kg bw)(P．O．)；
E．牛樟芝滴丸3倍劑量(3X)實驗組：400 mg APAP／kg bw(I．P．)+牛樟芝滴丸(60顆／kg bw)(P．O．)；
F．牛樟芝滴丸5倍劑量(5X)實驗組：400 mg APAP／kg bw(I．P)+牛樟芝滴丸(100顆／kg bw) (P．O．)。
1．2 步驟
A組腹腔注射生理食鹽水(0．6ml／30g bw for mice)，B— F組腹腔注射400mg APAP／kg bw (0．6ml／30g bw formice)，每週兩次(星期一及四)於樣品灌喂前一小時進行肝炎誘導，減少藥物及樣品互相影響；並在A、B組每日灌胃d．d．water，在C組灌喂NAC(600 mS／kg bw for mice)，在D—F組則分別灌以試驗樣品，共為期八周。
所有實驗動物每週投予試驗樣品(d．d．H 0或NAC)後4小時，以尾
部采血方式檢測肝臟的生化功能：GOT(AST)、GPT(ALT)。
最後于第八周結束時全部犧牲，並剖腹取肝臟標本，秤重後將最大右葉肝割取一半固定於l0％ 的中性福馬林(formaline)液中，石蠟包封切片後分別作蘇木紫一伊紅染色(haematoxylin—eosin stain，HE stain)來進行病理學觀察外，並做膠原蛋白的特殊染色(Masson’strichrome stain)，以便評估肝纖維化程度。
另外將其餘肝臟分別進行檢測抗氧化成分glutathione(GSH)、glutathione per．oxidase(GSH Px)、glutathione reductase(GSH Rd)、glutathi—one Stransferase(GST)、superoxide dismutase(SOD)與catalase等酵素活性。
實驗資料統計分析採用SAS電腦統計套裝軟體(SASinstitute，Cary，NC)進行變異數分析(analysis of variance，ANOVA)，並以Duncan@test來測試不同處理間顯著差異效果(P<0．05)。
1．3 肝功能生化指數的檢測
所有小鼠血液樣品在室溫下放置一小時以使其凝結。再以冷凍離心機於4~C下每分鐘12，000 rpm離心5分鐘，來分離血清。再以自動生化分析儀檢測肝功能生化指數，如GOT、GPT等。
1．4 抗氧化功能相關產物及酵素活性之分析
(1)麩胱甘(Glutathione，GSH)濃度之分析Glutathione濃度的分析系採用Cayman Chemical公司生產的分析試劑組(glutathione assay kit)測定之，其檢測方法簡述如下。
取肝組織，以均質液(50 mmol／1 MES，1 mmolfl EDTA，1 mmol／1 DTr，pH 6—7)均質之，在10，000 g，4~C下離心15分鐘。取上清液以等體積的方式加入1 mol／1之metaphosphoric acid溶液混合之，於室溫下反應5分鐘後離心(3，000 g，2分鐘)，取上清液加入4 mol／1之triethanolamine(20：1，v／v)混合。取此混合液501xl加入150之assay Cocktail(MES，reconstituted Cofactor Mixture，recon．stituted Enzyme Mixture，reconstituted DNTB)，反應開始後，以plate reader讀取每5分鐘405 nm波長的吸光值至反應進行至30分時為止，計算GSH之濃度。
(2)麩胱甘過氧化酶(glutathione peroxidase，GPx)活性之分析GPx酵素的活性系使用Cayman Chemical公司生產的分析試劑組(glutathione peroxidase assay kit)測定之，其檢測方法簡述如下。
取肝臟細胞，以均質液(50 mmol／1 Tris—HC1，5 retool／1 EDTA，1 mmol／l D’YF，pH 7．5)均質之，在10，000 g，4℃下離心15分鐘。取上清液201~1加入1001~1的assay buffer(50 mmolfl Tris—HC1，5 mmol／1 EDTA，pH7．6)、501xl的CO—substrate液(1yophilized NADPH，glutathione，glutathione reductase)混合後，加入2O 含Gumenehydroperoxide的溶液開始反應。每分鐘以plate reader分析340 nm波長的吸光值並紀錄之，最後分析GPx酵素的活性(specific activity)。
(3)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性之測定SOD酵素的活性系使用Dojindo Molecular Technologies公司生產的分析試劑組(SOD assay kit—WST)測定之，其檢測方法簡述如下。
取肝組織加入適量緩衝液(0．32 mol／1Sucrose、l mmolfl EDTA、10 nmolfl Tris—HC1，pH 7．4)均質之。以1，400g離心5分鐘，取上清液，再以4，500 g離心1O分鐘，下層之沈澱物加入緩衝液測Cu／Zn—SOD(cytosolic SOD)，上清液再以11，000 g離心60分鐘，取沈澱物加入緩衝液分析Mn—SOD (mitochondrial SOD)。
每20微升的檢體，加入200 的Reagent Solution及20 的EnzymeWorking Solution，於37℃反應20分鐘，再讀取450 am波長的吸光值並計算SOD的活性。肝組織SOD活性，以每單位蛋白質所含SOD單位量表示(U／mg protein)。
(4)蛋白質濃度之測定
實驗參照Lowry之方法進行(Lowry et a1．，1951)。取適量蛋白質樣品，並以1 N NaOH來調整使其最終體積為100 ml，加入200 ml去離子水及100 ml反應混合液(25％Na2CO3 ：2％ Na—K—tartarate ：1％ CuSO4 = 8 ：1：1，v／v／v)，然後在室溫下靜置10分鐘，加入1 ml Folin reagent(Folin：H20 =1：19．5)後於37℃水浴2O分鐘，並在室溫下冷卻，最後在分光光度計以660 nm下測其吸光值(25℃)。然後將標準曲線做線性回歸，得一方程式，將所得樣品之吸光值代入此一元一次方程式，換算後即可得知樣品之蛋白質含量。
1．5 實驗資料統計分析
所有的資料均以平均值4-標準差來表示(mean 4-SD)。不同藥物處理的組別以變異數分析(ANOVA)計算，並以Duncan’s post—hoc test評估其統計上之差異；P值小於0．05者表示具有顯著的差異。
2．結果與結論
2．1 牛樟芝滴丸對肝功能相關酵素活性的影響
從西醫的角度，當肝臟受到疾病或及他因素導致肝細胞的損傷時，可以由血中的肝功能生化指數上升來進行初步的檢測。一般而言，指的就是血液中GPT及GOT兩種酵素的活性上升。 因此，對於藥物或是健康食品是否具有療效或是保護肝功能的作用，可以由該藥物或健康食物是否能回復其肝功能著手(Wonget a1．，2000；Hase et a1．，1996)。
負對照組的小鼠經腹腔注射乙醯胺基苯酚(APAP)後，其血清GOT、GPT的指數，在處理後的第一周，顯著的較正常對照組為高，顯示APAP在一周時己對小鼠的肝臟產生損壞，同時，GOT及Girl”的指數到實驗結束前仍維持顯著上升的現象。因此，本項實驗動物模式確實為慢性肝損傷動物，可供藥物或健康食品進行護肝功效的評估。
正對照組除注射APAP之外，同時也以口服的方式給予小鼠N一乙醯半胱胺酸(N—acetylcysteine，NAC)治療。與正常對照組相較，處理一到八周的GOT及GPT的指數均顯著的較高，然而與負對照組相較，則明顯的降低。
治療組的GOT及GPT指數，在實驗過程中雖顯著的較正常對照組為高，然而經口服給予牛樟芝滴丸的治療後，與負對照組相較，其GOT及GPT指數可隨著牛樟芝滴丸劑量的增加，呈現劑量相關性的降低。
2．2 牛樟芝滴丸對小鼠肝臟中各種抗氧化功能相關成份及酵素活性的影響
機體組織中有一系列有效的抗自由基損傷系統，其中最重要的酵素有超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)。SOD是一種金屬酶，Cu／Zn—SOD主要存在於真核細胞的細胞漿內，由兩個亞基組成，每個亞基含1個銅和1個鋅；Mn—SOD存在於真核細胞的粒腺體，由4個亞基組成，每個亞基各含1個錳；這兩種SOD皆能清除體內自由基，減輕自由基對細胞的損傷(Wells eta1．，1997，Gutteridge＆Halliwell，2000)。
其它的自由基清道夫(scaven．ger)，如麩胱甘過氧化酶(glutathione pemxidase，GPx)在清除氧自由基也有其重要性(Arthur，2000)。
GSH是體內抵抗外來有害物質最強的防禦物質(Ketterer，1998)，而SOD及GPx清除自由基的能力與酵素活性成正比。小鼠經8周的不同處理後，其肝臟細胞glutathione(GSH)的濃度，以經過APAP處理八周後的負對照組小鼠為最低。
NAC或牛樟芝滴丸處理後之組別，其GSH濃度則較負對照組顯著的提高；同時，牛樟芝滴丸的此項作用並具劑量相關性。經過APAP處理八周後的負對照組小鼠，其肝臟細胞GPx活性顯著的較正常對照組為低。
NAC處理八周後之正對照組小鼠的GPx活性，與正常對照組相較則沒有顯著差異；而且，也顯著的較負對照組為高。小鼠經口服給予牛樟芝滴丸治療後，與負對照組相較，其GPx活性可隨著牛樟芝滴丸劑量的增加，逐漸地恢復；與正常對照組相較無顯著異差。
負對照組小鼠肝臟超氧化歧化酶(SOD)的活性檢測結果顯示，APAP處理八周後，其SOD的活性，包括銅一鋅型SOD (Cu／Zn—SOD)及錳型SOD(Mn—SOD)均較正常對照組為低。
經過NAC處理八周後的正對照組，小鼠肝臟的兩種SOD活性均顯著的較負對照組為高。口服牛樟芝滴丸八周後的小鼠，不論是Mn—SOD的活性或是Cu／Zn—SOD的活性皆會隨著牛樟芝滴丸劑量的增加而逐漸的提高。
由此可知，牛樟芝滴丸和NAC具有雷同的效果，能使因被APAP損壞之肝細胞其粒腺體及網狀內皮組織系統恢復正常，對於肝功能指數或是抗氧化酶具有回復作用。
綜上所述，由血中肝功能生化指數檢測結果顯示，大白鼠腹腔注射APAP會升高血中GOT及GPT指數，肝臟細胞的GSH濃度也會減少，SOD及GPx的酵素活性也都下降。牛樟芝滴丸可降低GOT及GPT指數，升高GSH濃度，並且可回復SOD及GPx等相關抗氧化酶的酵素活性的表現，對於保護肝臟功能確有幫助。因此牛樟芝滴丸具有肝臟保護效果。
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