作者：程利娟
北京軍區聯勤部藥品儀器檢驗所
解放軍醫藥雜誌 2014年5月 第26卷 第5期
文章編號 2095-140X( 2014) 05-0076-03
摘要
目的 採用高效液相色譜法測定牛樟芝中腺苷的含量。
方法 色譜柱: Agilent Zorbax SB-C18柱( 4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ， 流動相: 乙腈－ 0.01 mol /L 磷酸二氫鉀溶液( 6∶ 94) ，流速: 1. 0 ml/min，檢測波長: 260 nm，柱溫: 30℃，進樣量: 10 μl。
結果 腺苷在2.696 ～ 67.40 g /ml 範圍內與其峰面積呈現良好的線性關係( r = 0.999 9) ，平均回收率為99.89%，相對標準差為1.71%( n = 6) 。
結論 該方法簡便準確，靈敏度高，重複性好，為控制牛樟芝的品質提供了科學依據。
牛樟芝( Antrodiacamphorata) 又名牛樟菇、樟菇、樟芝、陰陽對口菇、靈芝之王、血靈芝、棺花，為臺灣地區特有真菌品種，具有抗腫瘤、增加免疫能力、抗細菌、抗病毒、抗過敏、抗高血壓、降血糖、降膽固醇、抑制血小板凝集及保護肝臟等生理活性，而且不良反應很少[1-2]。
現代科學研究表明，牛樟芝含有三萜類化合物、多糖、腺苷、超氧歧化酶、有機鍺、蛋白質( 含免疫蛋白) 、維生素、煙鹼酸、麥角固醇等多種有效成分[3]。
腺苷作為牛樟芝重要活性成分之一，能夠降低體外迴圈後肺缺血－ 再灌注損傷，有效改善右心功能，對再灌注心臟具有保護作用，同時提高血液供氧能力和加速血液微循環，提高血液對心腦的供氧能力[4-8]，是牛樟芝發揮藥理作用的主要成分之一，但目前尚未見以腺苷作為牛樟芝內在品質評價指標的相關報導。
為了進一步嚴格控制中藥材的品質，確保臨床用藥的有效性，本實驗採用高效液相色譜法測定牛樟芝中腺苷的含量，以期為牛樟芝的品質控制提供參考。
腺苷分子式
1 儀器與試藥
Agilent 1100 型高效液相色譜儀( 包括四元泵，VWD 檢測器，自動進樣器，ChemStation 化學工作站) ; Mettler-Toledo AX205 電子天平( 梅特勒－ 托利多儀器有限公司) ; KQ-300VDB 型雙頻數控超聲波清洗器( 昆山超聲儀器有限公司)。
腺苷對照品( 中國藥品生物製品檢定所，批號:110879-200202) ，牛樟芝藥材 ，甲醇、磷酸二氫鉀、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。
2 方法與結果
2. 1 色譜條件Agilent Zorbax SB-C18色譜柱( 4. 6 mm × 250 mm，5 μm ) ，流動相: 乙腈－0. 01 mol /L 磷酸二氫鉀溶液( 6 ∶ 94 ) ，流速:1. 0 ml /min，檢測波長: 260 nm，柱溫: 30℃，進樣量:10 μl。
2. 2 系統適應性試驗在上述色譜條件下，腺苷色譜峰的理論塔板數＞ 10 000，分離度為2. 95，拖尾因數為0.97，色譜圖見圖1。
圖1 腺苷( A) 和牛樟芝樣品( B) 的高效液相色譜圖
2. 3 溶液的製備
2. 3. 1 對照品溶液製備: 精密稱取腺苷對照品13. 48 mg，加15% 甲醇定容至100 ml，製成濃度為134. 8 μg /ml 的對照品儲備液，置4 C 冰箱保存。
2. 3. 2 供試品溶液製備: 取牛樟芝粉末( 過三號篩) 1. 0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入15%甲醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理( 功率300 W，頻率45 kHz) 30 min，放冷，再稱定重量，用15%甲醇補足減失的重量，搖勻0. 45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。
2. 4 線性關係考察精密量取腺苷對照品儲備液0. 2、1. 0、2. 0、3. 0、5. 0 ml 分別置於10 ml 量瓶中，加15% 甲醇定容，搖勻，製成濃度分別為2. 696、13. 48、26. 96、40. 44、67. 40 μg /ml 的標準品溶液，按“2. 1”項下色譜條件測定峰面積，以濃度為橫坐標( X) ，峰面積為縱坐標( Y) ，繪製標準曲線，得回歸方程: Y = 32. 499X + 0. 1498( r = 0. 999 9，n = 6) ，表明腺苷在2. 696 ～ 67. 40 μg /ml 範圍內與其峰面積呈良好的線性關係。
2. 5 精密度試驗精密吸取濃度為40. 44 μg /ml的對照品溶液，按“2. 1”項下色譜條件連續進樣6次，峰面積的相對標準差( ＲSD) 為0. 58%，表明儀器的精密度良好。
2. 6 穩定性試驗取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 按“2. 1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，結果腺苷峰面積的ＲSD 為0. 99% ( n = 6) ，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。
2. 7 重複性試驗取同一批樣品6 份，按“2. 3. 2”項下方法製成供試品溶液，進樣測定，結果樣品中腺苷平均含量為1. 18 mg /g，ＲSD 為0. 93%，表明該方法重複性良好。
2. 8 加樣回收率測定精密稱取6 份已知含量1. 18 mg /g) 的牛樟芝樣品( 批號20121025) 0. 1 g，分別精密加入40. 44 μg /ml 的腺苷對照品溶液3. 0 ml，按“2. 3. 2”項下方法製成供試品溶液，測定腺苷含量，計算回收率，結果見表1。
2. 9 樣品含量測定按“2． 3． 2”項下方法製備供試品溶液，按“2． 1”項下色譜條件測定3 批樣品的含量，每份樣品平行測定3 份，結果腺苷的含量分別為1.18、1. 27、1. 21 mg /g，ＲSD 分別為0.97%、1. 27%、1.14%。 3 討論 3. 1 流動相的選擇採用高效液相色譜法測定腺苷含量的報導較多，以甲醇－ 磷酸二氫鉀體系較多見，但是分析時間較長[9-18]。參考其他文獻，發現乙腈－ 磷酸二氫鉀體系也常用於腺苷含量的測定[19-23]。 研究比較發現，乙腈－ 磷酸二氫鉀溶液作為流動相體系的基線較甲醇－ 磷酸二氫鉀體系穩定，通過比較乙腈－ 0. 01 mol /L 磷酸二氫鉀溶液、乙腈－ 0. 02mol /L 磷酸二氫鉀溶液、乙腈－0.05 mol /L磷酸二氫鉀溶液等多種流動相體系，發現乙腈－ 0.01 mol /L 磷酸二氫鉀溶液效果最好，而高比例磷酸鹽的存在可能對泵和色譜柱造成損害[24]。 3. 2 色譜柱的選擇通過對Agilent Zorbax SB-C18，Agilent Zorbax SB-C8，Agilent Eclipse XDB-C18多個不同填料色譜柱用於腺苷的分離效果進行比較，發現腺苷在Agilent Zorbax SB-C18色譜柱的分離效果最好，故選擇Agilent Zorbax SB-C18開展試驗。 3. 3 提取溶劑的選擇通過比較甲醇、45% 甲醇、15%甲醇、水4 種不同提取溶劑對試驗的影響發現，提取溶劑為15% 甲醇時，腺苷的提取量較高，色譜圖中雜質峰的影響較小，可能是由於牛樟芝中含有大量多糖成分，在使用甲醇處理時多糖和其他大分子物質發生沉澱，情況得到改善，因此，選擇15% 甲醇為提取溶劑。 人工栽培牛樟芝藥用價值較高，但價格昂貴，因此通過測定有效成分的含量，對培養條件、培養方式進行優化顯得尤為重要，可進一步保證和提高牛樟芝產品的品質。 ［參考文獻］ ［1］ 張東柱． 臺灣特有珍貴藥用真菌牛樟芝［J］． 食藥用菌， 2011， 19( 1) : 33-34． ［2］ 徐蔚，王瑾，王宮． 牛樟芝膠囊的毒性實驗研究［J］． 海峽藥學， 2011， 23( 5) : 41-43． ［3］ 劉典謨，段俊國． 臺灣特產牛樟芝滴丸護肝功效實驗研究［J］． 中國民族民間醫藥， 2012， 21( 8) : 55-56． ［4］ 賀曉楠，王雪梅，陳樹濤，等． 腺苷對急性心肌梗死患者再灌注損傷的作用觀察［J］． 山東醫藥，2011，51( 52) : 89-90． ［5］ 韋碧柳，李國平，蒲澤錦，等． 腺苷誘導人食管癌EC109細胞凋亡及其內質網分子機制［J］． 中國藥理學與毒理學雜誌， 2011， 25( 6) : 532-537． ［6］ 馮向飛，李毅剛，王群山，等． 腺苷對流出道室性早搏的影響及其安全性［J］． 中國心臟起搏與心電生理雜誌， 2012， 26( 2) : 125-129． ［7］ 付豔平，王雪瑩，付立波，等． 腺苷對正常家兔頸總動脈血壓的影響及機制［J］． 山東醫藥， 2012， 52( 1) : 41-42． ［8］ 周建美，鄒定全，冉珂，等． 2-氯環戊腺苷預處理延遲相對兔缺血一再灌注損傷心肌aB-晶狀體蛋白的影響［J］． 臨床麻醉學雜誌， 2011， 27( 3) : 284-286． ［9］ 令紅豔． 不同板藍根製劑腺苷含量測定及其抗炎作用比較［J］． 中國實驗方劑學雜誌，2012，18 ( 11) : 143-145． ［10］ 郭濤，張龍，王兵，等． 不同培養基培育蛹蟲草中的蟲草素和腺苷含量測定［J］． 蠶業科學，2011，37 ( 6) :1117-1122． ［11］ 韓志建，宋愛榮，孫曉波，等． 樟芝膠囊生產工藝中發酵液與醇沉多糖中腺苷含量的測定［J］． 山東農業科學， 2012， 44( 8) : 108-110． ［12］ 周偉平，高曉霞，代安國，等． HPLC 法測定西藏主產區冬蟲夏草中尿苷和腺苷的含量［J］． 廣東藥學院學報，2011， 27( 6) : 591-595． ［13］ 李全學． 百令膠囊中甘露醇及腺苷(含量測定方法的改進［J］． 中國藥師，2010，13( 5) : 683-684． ［14］ 王二麗，何榮和． HPLC 法測定中藥靈芝中腺苷的含量［J］． 海峽藥學， 2009， 21( 3) : 46-47． ［15］ 薑麗珍，胡端龍，奚靜芳，等． ＲP-HPLC 法測定靈芝膠囊中腺苷［J］． 中成藥， 2012， 34( 2) : 377-379． ［16］ 唐勇，周春菊． 高效液相色譜法測定靈芝口服液中腺苷含量［J］． 藥物鑒定， 2008， 17( 10) : 31-32． ［17］ 嚴華，張幸梅，宋金翠，等． 靈芝膠囊中腺苷、腺嘌呤的TLC 鑒別及腺苷的HPLC 法含量測定［J］． 藥物分析雜誌， 2008， 28( 11) : 1800-1803． ［18］ 宋細忠，習梅蘭． HPLC 法同時測定靈芝浸膏片中尿苷和腺苷的含量［J］． 江西中醫學院學報， 2011，3( 1) : 62-63． ［19］ 徐穎，王斌． 高效液相色譜法測定靈芝飲片中腺苷［J］． 中草藥， 2010， 41( 12) : 2003-2004． ［20］ 李軍，任孝德，魏晨陽，等． HPLC 法測定靈芝膠囊中腺苷的含量［J］． 中醫研究， 2008， 21( 9) : 19-20． ［21］ 吳燕，劉園，張福成，等． 腺苷鈷胺凝膠中腺苷鈷胺的含量測定［J］． 醫藥導報， 2012， 31( 1) : 77-79． ［22］ 王風秋，胡德奇，張建軍，等． 不同省區苦碟子中腺苷的含量研究［J］． 中國醫藥導報， 2011，8( 10) : 66-67． ［23］ 孫倩，張術，儲智勇，等． 高效液相色譜法測定冬蟲夏草口服液中腺苷的含量［J］． 解放軍藥學學報， 2011， 27( 1) : 72-73． ［24］ 俞曉玲，黃宏南，李曄，等． HPLC-PDA 法測定不同系列靈芝產品中的腺苷含量［J］． 海峽預防醫學雜誌，2009， 15( 3) : 57-59．
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2 方法與結果
2. 1 色譜條件Agilent Zorbax SB-C18色譜柱( 4. 6 mm × 250 mm，5 μm ) ，流動相: 乙腈－0. 01 mol /L 磷酸二氫鉀溶液( 6 ∶ 94 ) ，流速:1. 0 ml /min，檢測波長: 260 nm，柱溫: 30℃，進樣量:10 μl。
2. 2 系統適應性試驗在上述色譜條件下，腺苷色譜峰的理論塔板數＞ 10 000，分離度為2. 95，拖尾因數為0.97，色譜圖見圖1。
圖1 腺苷( A) 和牛樟芝樣品( B) 的高效液相色譜圖
2. 3 溶液的製備
2. 3. 1 對照品溶液製備: 精密稱取腺苷對照品13. 48 mg，加15% 甲醇定容至100 ml，製成濃度為134. 8 μg /ml 的對照品儲備液，置4 C 冰箱保存。
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2. 4 線性關係考察精密量取腺苷對照品儲備液0. 2、1. 0、2. 0、3. 0、5. 0 ml 分別置於10 ml 量瓶中，加15% 甲醇定容，搖勻，製成濃度分別為2. 696、13. 48、26. 96、40. 44、67. 40 μg /ml 的標準品溶液，按“2. 1”項下色譜條件測定峰面積，以濃度為橫坐標( X) ，峰面積為縱坐標( Y) ，繪製標準曲線，得回歸方程: Y = 32. 499X + 0. 1498( r = 0. 999 9，n = 6) ，表明腺苷在2. 696 ～ 67. 40 μg /ml 範圍內與其峰面積呈良好的線性關係。
2. 5 精密度試驗精密吸取濃度為40. 44 μg /ml的對照品溶液，按“2. 1”項下色譜條件連續進樣6次，峰面積的相對標準差( ＲSD) 為0. 58%，表明儀器的精密度良好。
2. 6 穩定性試驗取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 按“2. 1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，結果腺苷峰面積的ＲSD 為0. 99% ( n = 6) ，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。
2. 7 重複性試驗取同一批樣品6 份，按“2. 3. 2”項下方法製成供試品溶液，進樣測定，結果樣品中腺苷平均含量為1. 18 mg /g，ＲSD 為0. 93%，表明該方法重複性良好。
2. 8 加樣回收率測定精密稱取6 份已知含量1. 18 mg /g) 的牛樟芝樣品( 批號20121025) 0. 1 g，分別精密加入40. 44 μg /ml 的腺苷對照品溶液3. 0 ml，按“2. 3. 2”項下方法製成供試品溶液，測定腺苷含量，計算回收率，結果見表1。2. 9 樣品含量測定按“2． 3． 2”項下方法製備供試品溶液，按“2． 1”項下色譜條件測定3 批樣品的含量，每份樣品平行測定3 份，結果腺苷的含量分別為1.18、1. 27、1. 21 mg /g，ＲSD 分別為0.97%、1. 27%、1.14%。 3 討論 3. 1 流動相的選擇採用高效液相色譜法測定腺苷含量的報導較多，以甲醇－ 磷酸二氫鉀體系較多見，但是分析時間較長[9-18]。參考其他文獻，發現乙腈－ 磷酸二氫鉀體系也常用於腺苷含量的測定[19-23]。 研究比較發現，乙腈－ 磷酸二氫鉀溶液作為流動相體系的基線較甲醇－ 磷酸二氫鉀體系穩定，通過比較乙腈－ 0. 01 mol /L 磷酸二氫鉀溶液、乙腈－ 0. 02mol /L 磷酸二氫鉀溶液、乙腈－0.05 mol /L磷酸二氫鉀溶液等多種流動相體系，發現乙腈－ 0.01 mol /L 磷酸二氫鉀溶液效果最好，而高比例磷酸鹽的存在可能對泵和色譜柱造成損害[24]。 3. 2 色譜柱的選擇通過對Agilent Zorbax SB-C18，Agilent Zorbax SB-C8，Agilent Eclipse XDB-C18多個不同填料色譜柱用於腺苷的分離效果進行比較，發現腺苷在Agilent Zorbax SB-C18色譜柱的分離效果最好，故選擇Agilent Zorbax SB-C18開展試驗。 3. 3 提取溶劑的選擇通過比較甲醇、45% 甲醇、15%甲醇、水4 種不同提取溶劑對試驗的影響發現，提取溶劑為15% 甲醇時，腺苷的提取量較高，色譜圖中雜質峰的影響較小，可能是由於牛樟芝中含有大量多糖成分，在使用甲醇處理時多糖和其他大分子物質發生沉澱，情況得到改善，因此，選擇15% 甲醇為提取溶劑。 人工栽培牛樟芝藥用價值較高，但價格昂貴，因此通過測定有效成分的含量，對培養條件、培養方式進行優化顯得尤為重要，可進一步保證和提高牛樟芝產品的品質。 ［參考文獻］ ［1］ 張東柱． 臺灣特有珍貴藥用真菌牛樟芝［J］． 食藥用菌， 2011， 19( 1) : 33-34． ［2］ 徐蔚，王瑾，王宮． 牛樟芝膠囊的毒性實驗研究［J］． 海峽藥學， 2011， 23( 5) : 41-43． ［3］ 劉典謨，段俊國． 臺灣特產牛樟芝滴丸護肝功效實驗研究［J］． 中國民族民間醫藥， 2012， 21( 8) : 55-56． ［4］ 賀曉楠，王雪梅，陳樹濤，等． 腺苷對急性心肌梗死患者再灌注損傷的作用觀察［J］． 山東醫藥，2011，51( 52) : 89-90． ［5］ 韋碧柳，李國平，蒲澤錦，等． 腺苷誘導人食管癌EC109細胞凋亡及其內質網分子機制［J］． 中國藥理學與毒理學雜誌， 2011， 25( 6) : 532-537． ［6］ 馮向飛，李毅剛，王群山，等． 腺苷對流出道室性早搏的影響及其安全性［J］． 中國心臟起搏與心電生理雜誌， 2012， 26( 2) : 125-129． ［7］ 付豔平，王雪瑩，付立波，等． 腺苷對正常家兔頸總動脈血壓的影響及機制［J］． 山東醫藥， 2012， 52( 1) : 41-42． ［8］ 周建美，鄒定全，冉珂，等． 2-氯環戊腺苷預處理延遲相對兔缺血一再灌注損傷心肌aB-晶狀體蛋白的影響［J］． 臨床麻醉學雜誌， 2011， 27( 3) : 284-286． ［9］ 令紅豔． 不同板藍根製劑腺苷含量測定及其抗炎作用比較［J］． 中國實驗方劑學雜誌，2012，18 ( 11) : 143-145． ［10］ 郭濤，張龍，王兵，等． 不同培養基培育蛹蟲草中的蟲草素和腺苷含量測定［J］． 蠶業科學，2011，37 ( 6) :1117-1122． ［11］ 韓志建，宋愛榮，孫曉波，等． 樟芝膠囊生產工藝中發酵液與醇沉多糖中腺苷含量的測定［J］． 山東農業科學， 2012， 44( 8) : 108-110． ［12］ 周偉平，高曉霞，代安國，等． HPLC 法測定西藏主產區冬蟲夏草中尿苷和腺苷的含量［J］． 廣東藥學院學報，2011， 27( 6) : 591-595． ［13］ 李全學． 百令膠囊中甘露醇及腺苷(含量測定方法的改進［J］． 中國藥師，2010，13( 5) : 683-684． ［14］ 王二麗，何榮和． HPLC 法測定中藥靈芝中腺苷的含量［J］． 海峽藥學， 2009， 21( 3) : 46-47． ［15］ 薑麗珍，胡端龍，奚靜芳，等． ＲP-HPLC 法測定靈芝膠囊中腺苷［J］． 中成藥， 2012， 34( 2) : 377-379． ［16］ 唐勇，周春菊． 高效液相色譜法測定靈芝口服液中腺苷含量［J］． 藥物鑒定， 2008， 17( 10) : 31-32． ［17］ 嚴華，張幸梅，宋金翠，等． 靈芝膠囊中腺苷、腺嘌呤的TLC 鑒別及腺苷的HPLC 法含量測定［J］． 藥物分析雜誌， 2008， 28( 11) : 1800-1803． ［18］ 宋細忠，習梅蘭． HPLC 法同時測定靈芝浸膏片中尿苷和腺苷的含量［J］． 江西中醫學院學報， 2011，3( 1) : 62-63． ［19］ 徐穎，王斌． 高效液相色譜法測定靈芝飲片中腺苷［J］． 中草藥， 2010， 41( 12) : 2003-2004． ［20］ 李軍，任孝德，魏晨陽，等． HPLC 法測定靈芝膠囊中腺苷的含量［J］． 中醫研究， 2008， 21( 9) : 19-20． ［21］ 吳燕，劉園，張福成，等． 腺苷鈷胺凝膠中腺苷鈷胺的含量測定［J］． 醫藥導報， 2012， 31( 1) : 77-79． ［22］ 王風秋，胡德奇，張建軍，等． 不同省區苦碟子中腺苷的含量研究［J］． 中國醫藥導報， 2011，8( 10) : 66-67． ［23］ 孫倩，張術，儲智勇，等． 高效液相色譜法測定冬蟲夏草口服液中腺苷的含量［J］． 解放軍藥學學報， 2011， 27( 1) : 72-73． ［24］ 俞曉玲，黃宏南，李曄，等． HPLC-PDA 法測定不同系列靈芝產品中的腺苷含量［J］． 海峽預防醫學雜誌，2009， 15( 3) : 57-59．
